一、产品简介

本产品全化学成分确定、无血清培养体系，精准模拟基底微环境，显著缩短原代启动周期，实现从活检组织到类器官的高效建立与长期无损扩增 ，支持连续传代且维持高活性和遗传稳定性 ，所获类器官具优异谱系可塑性 。 通过后续与人表皮类器官完全培养基(分化/ALI)配套的气液界面（ALI）培养或分化诱导，可复现完整表皮层级结构。针对小样本优化，提升成球率与建系成功率，为高通量药物筛选、皮肤药理毒理评估及个体化皮肤研究提供可靠技术平台。

二、产品信息

三、 自备试剂、耗材和仪器

自备/选购配套试剂

自备耗材和仪器

(1)    生物安全柜、CO2 培养箱（37℃ ,   5% CO2）、离心机、水浴锅、倒置显微镜。

(2)    精密解剖剪、手术镊、60 mm 培养皿。

(3)    1.5 mL/15 mL/50 mL 离心管、 10 mL 移液管、无菌低吸附移液枪头（P1000/P200）、 100 μm 无菌细胞筛网。

(4)    24 孔或 48 孔组织培养板（TC-Treated）。

四、人表皮类器官完全培养基制备说明

(1)    试剂解冻：提前将人表皮类器官基础添加物 B 和培养基添加物 C 置于冰上或 4℃冰箱缓慢融化。使用前轻柔颠倒混匀（切勿剧烈涡旋）。

(2)    无菌混合：在超净工作台中，将培养基添加物 B 和培养基添加物 C 分别按照稀释倍数加入 A 瓶中 ，充分混匀。此时 ，您已得到人表皮类器官完全培养基。

*注意：完全培养基中已含 1% Pen-Strep Solution，无需另行添加。

(3)    提高类器官建成率：在建系/传代/复苏首日可每 10 mL 配置好的完全培养基中加入 10  μL 的  Starter 增强剂（SA321716）。类器官成 熟稳定生长后无需添加。

(4)    分装储存：建议按日常用量分装（如 10 mL/管） ，置于-20℃保存。开封后 4℃请于 2 周内用完 ，避免反复冻融。

五、原代人表皮类器官构建

实验准备

(1)    基质胶置于冰上或 4℃提前解冻 ，每个胶滴 30 ~50 μL ，根据所需种板数量进行适当调整用量。

(2)    提前将接种用的培养板置于 37℃预热 30 min。

样本处理

*若新鲜样本无法立即处理或需要转运，请将组织样本浸没于组织样本保存液（SA321701）中保持 2~8℃,  48 h 内处理。

(1)    组织清洗：将人表皮组织块放入组织清洗液（SA321718）中，反复漂洗 3~5 次，以去除黏液及血块残留，直至清洗液澄清。

组织消化与收集

*后续步骤均需要使用类器官防黏附润洗液（SA321703）润洗枪头、移液管和离心管。

消化阶段 I（真皮-表皮分离）

(1)    展平：将清洗好的组织转移至新培养皿，真皮面向上，表皮面向下贴于皿底拨平。

(2)    组织消化：加入 5 mL  皮肤组织消化液Ⅰ（SA321710）。置于 4°C 过夜消化 12~15 h。

(3)    剥离：吸弃消化液，加入预冷类器官清洗液（SA321711）。将组织块移动到培养皿。调整组织条的方向，使表皮朝上。用两把无齿弯镊， 一把压住真皮，另一把轻轻撕下薄膜状的表皮层。快速操作，为每个组织块重复该过程。

消化阶段 I（组织到细胞团）

(1)    剪碎：将剥下的表皮移入 1.5 mL EP 管，预加 200  μL 皮肤组织消化液Ⅱ（SA321710） ，用眼科剪迅速剪成 1 mm³以下的微小碎块。

(2)    二次消化：转移至预润洗过的 15 mL 离心管，加入 2~5 m 皮肤组织消化液Ⅱ（SA321710）。37℃消化 30~60 min。每隔 10 min上下摇晃离心管。镜下观察，直至看到大部分细胞呈团块状（勿消化成单细胞状态） ，即可终止消化。

(3)    终止消化：加入 5~10 mL 类器官清洗液（SA321711） ，终止消化。移液器吹打 10 次以释放表皮细胞，300×g 离心 3 min，弃上清。

(4)    细胞筛过滤：加入 10 mL 类器官清洗液（SA321711）重悬细胞，将细胞悬液通过预先润洗的 100  μm 无菌细胞筛网过滤，于 50 mL 离心管收集滤液。 300×g 离心 3 min ，弃上清。

种板培养

(1)    计数：取 1 mL 类器官清洗液（SA321711） ，利用细胞计数仪或手动计数板进行计数。取 10 μL 悬液与等体积台盼蓝混匀并加入计数板 ，置于显微镜或细胞计数仪观测和分析活细胞比例。 300×g 离心3 min ，弃上清 ，收集组织细胞沉淀。

(2)    重悬：用预冷的移液器枪头，加入适量基质胶重悬沉淀。基质胶的用量为每个胶滴 30 ~40 μL。重悬过程应迅速（不超过 30s）、轻柔避免产生气泡。推荐重悬密度为每个胶滴含有 1000 ~ 1500 个细胞团。基质胶体积比应不低于 70%以保证培养过程中基质胶的结构稳定。

*此步骤应迅速完成。

(3)    点胶：用预冷的 P200 移液器 ，吸取 30 ~50 μL 基质胶-人表皮细胞团混合物 ，垂直、快速地接种在预热的培养板孔中央。确保枪头尖端不接触孔底。重复此操作 ，为每个孔点胶。

(4)    固化：将培养板小心转移至培养箱中 ，正置孵育 3 min ，随后倒置孵育 20 ~30 min ，使基质胶聚合成固体圆顶 ，以防组织团沉降接触孔底。

(5)    补液：基质胶固化后，从培养箱中取出培养板。沿着 24 孔板孔壁一侧，缓慢地向每个孔中加入 500  μL 已配制好的完全培养基（完全浸没胶滴）。

*切勿将培养基直接吹打在基质胶穹顶上 ，以免使其破裂。

类器官培养与维护

(1)    培养：将培养板放入 37℃ ,   5% CO2  的恒温培养箱中培养。

(2)    观察：每天在显微镜下观察类器官的生长情况并拍照记录 ，一般在接种 3 ~4 天后 ，可观测到类器官形成。

(3)    换液：每 2 ~3 天更换一次培养基。用移液器小心吸弃旧培养基（同样沿孔壁操作）。加入 500  μL 新鲜的完全培养基。

六、人表皮类器官传代培养

*传代节点：当类器官生长旺盛（直径＞  100 μm）、密度过高（通常培养 5-10 天后）或培养基明显变黄时，需要进行传代。传代比例 1:2~1:3。

(1)    破胶：加入 1 mL 预冷的类器官清洗液（SA321711） ，用润洗过的枪头轻轻吹打，将基质胶穹顶吹散、溶解。将悬液收集至离心管， 300 × g 离心 5 min ，弃上清 ，注意不要吸到底部沉淀。

(2)    消化：加入 3mL 类器官消化液（若类器官数量较多 ，可适当增加类器官消化液用量） ，用润洗过的枪头轻轻吹打底部沉淀。将离心管置于 37℃,   5% CO2  的恒温培养箱中消化，每隔 5min 显微镜下观察类器官消化情况，待大部分类器官消化至 10-50 个细胞团（避免消化过度，影响类器官生长）时，加入 2 倍消化液体积  类器官清洗液（SA321711） ，终止消化。

(3)    收集与种板：离心管 300 × g 离心 3 min，弃上清，收集组织细胞沉淀。剩余步骤同“种板培养”（2）-（5）。

七、类器官冻存

观察类器官生长情况，确保类器官活性良好，数量不低于 500 个，多数类器官直径＞100  μM。使用 1 mL  类器官冻存液（SA321704 )  重悬类器官沉淀，重悬动作需轻柔，保持类器官的 3D 团块结构。将混悬液转入冻存管，立即放入程序降温盒。将降温盒置于-80℃冰箱过夜。长期储存：24 小时后，迅速将冻存管转移至液氮中长期保存。切勿在-80℃长期存放，否则会导致活性显著下降和复苏失败。

八、类器官复苏

(1)    快速融化：从液氮罐中取出冻存管，迅速投入 37℃水浴锅中。轻微摇动冻存管 ，使其在 1-2 min 内迅速融化，待管内尚存一小块冰晶时即可取出。

(2)    清洗与稀释：在超净工作台中，用润洗过的枪头将冻存管内的类器官悬液转移至防黏附润洗液（SA321703）润洗过的含有 5~10 mL 预冷类器官清洗液（SA321711）的 15 mL 离心管中。轻轻吹打混匀，使冻存液得到充分稀释。

(3)    离心收集：4℃,   300×g 离心 3 min。小心吸弃上清液，重复清洗并离心 1 次。

(4)    重悬与接种：参照“种板培养”步骤。

(5)    启动培养：沿孔壁缓慢加入 500 μL 已配制的人表皮类器官完全培养基。建议在复苏后的首个 48 h 每 1 mL 配置好的完全培养基中加入 1μL Starter 增强剂（SA321716） ，降低复苏初期的细胞应激，提高类器官的生长速度。

九、注意事项

(1)    安全提示：本产品仅供科学研究使用 ，不可用于临床诊断或治疗。使用前请仔细阅读本说明书。

(2)    正确储存：请严格按照推荐的温度储存培养基，不宜长时间置于室温。建议将培养基进行小规格分装，使用时解冻，以保障活性与效果。

(3)    无菌操作：本产品仅供类器官体外培养，实验室需具备培养条件，并且实验过程涉及的所有试剂和耗材必须保持无菌以防止污染。

(4)    操作环境：组织样本在采集过程中应遵循全程冰上操作；运输应使用组织运输保存液（SA321701）并始终保持 4℃运输环境。样本处理时应使用预冷的处理试剂以维持细胞活性。

(5)    个人防护：操作时需做好个人防护，身着合适的实验服并佩戴一次性口罩和手套。使用过程中产生的废弃物应按照医疗垃圾处理标准妥善处理。

(6)    本产品培养结果会受到组织采集过程、组织样本质量等因素影响；同时也受到技术人员操作习惯、操作环境以及当前细胞生物学技术发展局限性等限制 ，因此可能会存在培养失败的情况。

免责声明：本产品仅用于科学研究用途。用户需自行承担使用产品的全部风险。生产商不对因使用本产品引起的任何间接或附带损害承担责任。建议使用者根据自身实验体系进行条件优化。