一、产品简介

本产品专用于小鼠正常小肠组织来源的小肠类器官的诱导分化。能够稳定诱导分化为多种正常小肠功能性细胞与隐窝结构特征，适用于肠道发育生物学、肠道疾病模型构建及药物筛选等科研目的。

二、产品信息

三、 自备试剂、耗材和仪器

自备/选购配套试剂

自备耗材和仪器

(1)   生物安全柜、CO2 培养箱（37℃ ,  5% CO2）、离心机、水浴锅、倒置显微镜。

(2)    1.5 mL/15 mL/50 mL 离心管、无菌低吸附移液枪头（P1000/P200）。

(3)   24 孔或 48 孔组织培养板（TC-Treated）。

四、小鼠小肠类器官完全培养基制备说明

(1)   试剂解冻：提前将小鼠小肠类器官类器官基础添加物 B 和培养基添加物 C 置于冰上或 4℃冰箱缓慢融化。使用前轻柔颠倒混匀（切勿剧烈涡旋）。

(2)   无菌混合：在超净工作台中，将培养基添加物 B 和培养基添加物 C 分别按照稀释倍数加入 A 瓶中 ，充分混匀。此时 ，您已得到小鼠小肠类器官完全培养基。

*注意：完全培养基中已含 1% Pen-Strep Solution，无需另行添加。

(3)   提高类器官建成率：在建系/传代/复苏首日可每 10 mL 配置好的扩增完全培养基中加入 10  μL 的  Starter 增强剂（SA321716）。类器 官成熟稳定生长后无需添加。

(4)   分装储存：建议按日常用量分装（如 10 mL/管） ，置于-20℃保存。开封后 4℃请于 2 周内用完 ，避免反复冻融。

五、类器官复苏

(1)   快速融化：从液氮罐中取出冻存管，迅速投入 37℃水浴锅中。轻微摇动冻存管 ，使其在 1-2 min 内迅速融化，待管内尚存一小块冰晶时即可取出。

(2)   清洗与稀释：在超净工作台中，用润洗过的枪头将冻存管内的类器官悬液转移至防黏附润洗液（SA321703）润洗过的含有 5~10 mL 预冷类器官清洗液（SA321711）的 15 mL 离心管中。轻轻吹打混匀，使冻存液得到充分稀释。

(3)   离心收集：4℃,  300 × g 离心 3 min。小心吸弃上清液，重复清洗并离心 1 次。

(4)   重悬与接种：参照“种板培养”步骤。

(5)   启动培养：沿孔壁缓慢加入 500 μL 已配制的小鼠小肠类器官完全培养基。建议在复苏后的首个 48 h 每 1 mL 配置好的完全培养基中加入 Starter 增强剂（SA321716） ，降低复苏初期的细胞应激，提高类器官的生长速

度。*注意：建议复苏后的小肠类器官稳定传代后再进行分化，不建议直接在复苏当代次进行分化操作。

六、小鼠小肠类器官传代和分化

*传代节点：当类器官生长旺盛（直径＞  100 μm）、密度过高（通常培养 5-10 天后）或培养基明显变黄时，需要进行传代。传代比例 1:2~1:3。

(1)   破胶：加入 1 mL 预冷的类器官清洗液（SA321711） ，用润洗过的枪头轻轻吹打，将基质胶穹顶吹散、溶解。将悬液收集至离心管， 300 × g 离心 5 min ，弃上清 ，注意不要吸到底部沉淀。

(2)   消化：加入 3mL 类器官消化液（若类器官数量较多 ，可适当增加类器官消化液用量） ，用润洗过的枪头轻轻吹打底部沉淀。将离心管置于 37℃,  5% CO2  的恒温培养箱中消化，每隔 5min 显微镜下观察类器官消化情况，待大部分类器官消化至 10-50 个细胞团（避免消化过度，影响类器官生长）时，加入 2 倍消化液体积 类器官清洗液（SA321711） ，终止消化。

(3)   收集：离心管 300 × g 离心 3 min，弃上清，收集组织细胞沉淀。

(4)   重悬：用预冷的移液器枪头，加入适量基质胶重悬沉淀。基质胶的用量为每个胶滴 30-40 μL。重悬过程应迅速（不超过 30 s）、轻柔避免产生气泡。推荐重悬密度为每个胶滴含有 1000~1500 个细胞团。基质胶体积比应不低于 70%以保证培养过程中基质胶的结构稳定。

*此步骤应迅速完成。

(5)   点胶：用预冷的 P200 移液器 ，吸取 30~40 μL 基质胶-小鼠小肠细胞团混合物 ，垂直、快速地接种在预热的培养板孔中央。确保枪头尖端不接触孔底。重复此操作 ，为每个孔点胶。

(6)    固化：将培养板小心转移至培养箱中 ，正置孵育 3 min ，随后倒置孵育 20~30 min ，使基质胶聚合成固体圆顶 ，以防组织团沉降接触孔底。

(7)   补液：基质胶固化后，从培养箱中取出培养板。沿着 24 孔板孔壁一侧 ，缓慢地向每个孔中加入 500  μL 已配制好的类器官扩增完全培养基（完全浸没胶滴）。

(8)   将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养 ，待新长出的类器官直径为  100-200 μm   可进行分化实验。

(9)   分化前需要吸去 24 孔板培养孔中的小鼠结肠类器官扩增培养基，并加入 500 μL   提前配制的类器官分化完全培养基，分化通常需要 4 d 以上时间 ，分化期间每隔  2 d   更换一次分化培养基 ，分化完成后可进行后续实验。

七、注意事项

(1)   安全提示：本产品仅供科学研究使用 ，不可用于临床诊断或治疗。使用前请仔细阅读本说明书。

(2)   正确储存：请严格按照推荐的温度储存培养基，不宜长时间置于室温。建议将培养基进行小规格分装，使用时解冻，以保障活性与效果。

(3)   无菌操作：本产品仅供类器官体外培养，实验室需具备培养条件，并且实验过程涉及的所有试剂和耗材必须保持无菌以防止污染。

(4)   操作环境：组织样本在采集过程中应遵循全程冰上操作；运输应使用组织运输保存液（SA321701）并始终保持 4℃运输环境。样本处理 时应使用预冷的处理试剂以维持细胞活性。

(5)   个人防护：操作时需做好个人防护，身着合适的实验服并佩戴一次性口罩和手套。使用过程中产生的废弃物应按照医疗垃圾处理标准妥善处理。

(6)   本产品培养结果会受到组织采集过程、组织样本质量等因素影响；同时也受到技术人员操作习惯、操作环境以及当前细胞生物学技术发展局限性等限制 ，因此可能会存在培养失败的情况。

免责声明：本产品仅用于科学研究用途。用户需自行承担使用产品的全部风险。生产商不对因使用本产品引起的任何间接或附带损害承担责任。建议使用者根据自身实验体系进行条件优化。