一、产品简介

本产品专用于小鼠乳腺癌类器官的原始分离与稳定扩增培养。支持乳腺癌类器官的构建、传代扩增、冻存保存及复苏，能够稳定保留原始肿瘤组织的基因组与病理特征 ，适用于精准药物筛选及相关科学研究。

二、产品信息

三、 自备试剂、耗材和仪器

自备/选购配套试剂

自备耗材和仪器

(1)   生物安全柜、CO2 培养箱（37℃ ,  5% CO2）、离心机、水浴锅、倒置显微镜。

(2)   精密解剖剪、手术镊、60 mm 培养皿。

(3)    1.5 mL/15 mL/50 mL 离心管、10 mL 移液管、无菌低吸附移液枪头（P1000/P200）、100 μm 无菌细胞筛网。

(4)   24 孔或 48 孔组织培养板（TC-Treated）。

四、小鼠乳腺癌类器官完全培养基制备说明

(1)   试剂解冻：提前将小鼠乳腺癌类器官基础添加物 B 和培养基添加物 C 置于冰上或 4℃冰箱缓慢融化。使用前轻柔颠倒混匀（切勿剧烈涡旋）。

(2)   无菌混合：在超净工作台中 ，将培养基添加物 B 和培养基添加物 C 分别按照稀释倍数加入 A 瓶中 ，充分混匀。此时 ，您已得到乳腺癌类器官完全培养基。

*注意：完全培养基中已含 1% Pen-Strep Solution，无需另行添加。

(3)   提高类器官建成率：在建系/传代/复苏首日可每 10 mL 配置好的完全培养基中加入 10  μL 的  Starter 增强剂（SA321716）。类器官 成熟稳定生长后无需添加。

(4)   分装储存：建议按日常用量分装（如 10 mL/管） ，置于-20℃保存。开封后 4℃请于 2 周内用完 ，避免反复冻融。

五、原代小鼠乳腺癌类器官构建

实验准备

(1)   基质胶置于冰上或 4℃提前解冻 ，每个胶滴 30~50 μL ，根据所需种板数量进行适当调整用量。

(2)   提前将接种用的培养板置于 37℃预热 30 min。

样本处理

*若新鲜样本无法立即处理或需要转运，请将组织样本浸没于组织样本保存液（SA321701）中保持 2~8℃,  48 h 内处理。

(1)   样本获取：优先选取肿瘤活性区域（避免取中心坏死区、溃烂区或电刀严重烧灼炭化的边缘区域）。

(2)   组织清洗：将乳腺癌组织块放入组织清洗液（SA321718）中，反复漂洗 3~5 次，以去除黏液及血块残留，直至清洗液澄清。

组织消化与收集

*后续步骤均需要使用类器官防黏附润洗液（SA321703）润洗枪头、移液管和离心管。

(1)   清洗：用手术剪将乳腺癌手术样本剪切小块，组织清洗液（SA321718）冲洗乳腺癌手术样本 3~5 次，至清洗液澄清，弃去清洗液。

(2)   消化前准备：将组织转移至 60 mm 培养皿中，加入 50  μL 的肿瘤组织消化液（SA321708）冰上用无菌的组织剪将组织剪碎至 0.5~1 mm3 左右大小碎块，将切碎的组织转移至防黏附润洗液（SA321703）润洗过的 15ml 离心管。

(3)   组织消化：剪碎后的组织中加入 5 mL 的肿瘤组织消化液（SA321708） ，37℃消化 30~60 min。每隔 10 min 上下摇晃离心管。镜下 观察，直至看到大部分细胞呈团块状（勿消化成单细胞状态） ，即可终止消化。

(4)   终止消化：加入 5~10 mL 类器官清洗液（SA321711） ，终止消化。300 × g 离心 3 min，弃上清。

(5)   细胞筛过滤：加入 10 mL  类器官清洗液（SA321711） ，将细胞悬液通过预先润洗的 100 μm 无菌细胞筛网过滤，于 50 mL 离心管收 集滤液。300 × g 离心 3 min，弃上清。

(6)   红细胞裂解（可选）：观察沉淀，若沉淀较红则需进行红细胞裂解。加入 2 mL 红细胞裂解液（SA321702）重悬细胞，室温静置 3  min。加入 5 mL  类器官清洗液（SA321711）重悬细胞，终止裂解。300 × g 离心 3 min,  弃上清，收集沉淀。

种板培养

(1)   计数：取 1 mL 类器官清洗液（SA321711） ，利用细胞计数仪或手动计数板进行计数。取 10 μL 悬液与等体积台盼蓝混匀并加入计数 板 ，置于显微镜或细胞计数仪观测和分析活细胞比例。300 × g 离心3 min,弃上清 ，收集组织细胞沉淀。

(2)   重悬：用预冷的移液器枪头 ，加入适量基质胶重悬沉淀。基质胶的用量为每个胶滴 30-40 μL。重悬过程应迅速（不超过 30 s）、

轻柔避免产生气泡。推荐重悬密度为每个胶滴含有 1000~1500 个细胞团。基质胶体积比应不低于 70%以保证培养过程中基质胶的结构稳定。

*此步骤应迅速完成。

(3)   点胶：用预冷的 P200 移液器 ，吸取 30~50 μL 基质胶-乳腺癌细胞团混合物 ，垂直、快速地接种在预热的培养板孔中央。确保枪头尖端不接触孔底。重复此操作 ，为每个孔点胶。

(4)    固化：将培养板小心转移至培养箱中 ，正置孵育 3 min ，随后倒置孵育 20~30 min ，使基质胶聚合成固体圆顶 ，以防组织团沉降接触孔底。

(5)   补液：基质胶固化后 ，从培养箱中取出培养板。沿着 24 孔板孔壁一侧 ，缓慢地向每个孔中加入 500  μL 已配制好的完全培养基（完全浸没胶滴）。

*切勿将培养基直接吹打在基质胶穹顶上 ，以免使其破裂。

类器官培养与维护

(1)   培养：将培养板放入 37℃ ,  5% CO2  的恒温培养箱中培养。

(2)   观察：每天在显微镜下观察类器官的生长情况并拍照记录 ，一般在接种 3-4 天后 ，可观测到类器官形成。

(3)   换液：每 2~3 天更换一次培养基。用移液器小心吸弃旧培养基（同样沿孔壁操作）。加入 500  μL 新鲜的完全培养基。

六、小鼠乳腺癌类器官传代培养

*传代节点：当类器官生长旺盛（直径＞  100 μm）、密度过高（通常培养 5-10 天后）或培养基明显变黄时，需要进行传代。传代比例 1:2~1:3。

(1)   破胶：加入 1 mL 预冷的类器官清洗液（SA321711） ，用润洗过的枪头轻轻吹打，将基质胶穹顶吹散、溶解。将悬液收集至离心管， 300 × g 离心 5 min ，弃上清 ，注意不要吸到底部沉淀。

(2)   消化：加入 3mL 类器官消化液（若类器官数量较多 ，可适当增加类器官消化液用量） ，用润洗过的枪头轻轻吹打底部沉淀。将离心管置于 37℃,  5% CO2  的恒温培养箱中消化，每隔 5min 显微镜下观察类器官消化情况，待大部分类器官消化至 10-50 个细胞团（避免消化过度，影响类器官生长）时，加入 2 倍消化液体积 类器官清洗液（SA321711） ，终止消化。

(3)   收集与种板：离心管 300 × g 离心 3 min,弃上清，收集组织细胞沉淀。剩余步骤同“种板培养”（2）-（5）。

七、类器官冻存

观察类器官生长情况，确保类器官活性良好，多数类器官直径＞100 μM。使用 1 mL 类器官冻存液（SA321704）重悬类器官沉淀 ,  重悬动作需轻柔。将混悬液转入冻存管，立即放入程序降温盒。将降温盒置于-80℃冰箱过夜。长期储存：24 小时后，迅速将冻存管转移至液氮中长期保存。切勿在-80℃长期存放，否则会导致活性显著下降和复苏失败。

八、类器官复苏

(1)   快速融化：从液氮罐中取出冻存管 ，迅速投入 37℃水浴锅中。轻微摇动冻存管 ，使其在 1-2 min 内迅速融化 ，待管内尚存一小块冰晶时即可取出。

(2)   清洗与稀释：在超净工作台中，用润洗过的枪头将冻存管内的类器官悬液转移至防黏附润洗液（SA321703）润洗过的含有 5~10 mL预冷类器官清洗液（SA321711）的 15 mL 离心管中。轻轻吹打混匀，使冻存液得到充分稀释。

(3)   离心收集：4℃,  300 × g 离心 3 min。小心吸弃上清液，重复清洗并离心 1 次。

(4)   重悬与接种：参照“种板培养”步骤。

(5)   启动培养：沿孔壁缓慢加入 500 μL 已配制的乳腺癌类器官完全培养基。建议在复苏后的首个 48 h 每 1 mL 配置好的完全培养基中加入 1μL Starter 增强剂（SA321716） ，降低复苏初期的细胞应激，提高类器官的生长速度。

九、注意事项

(1)   安全提示：本产品仅供科学研究使用 ，不可用于临床诊断或治疗。使用前请仔细阅读本说明书。

(2)   正确储存：请严格按照推荐的温度储存培养基 ，不宜长时间置于室温。建议将培养基进行小规格分装 ，使用时解冻 ，以保障活性与效果。

(3)   无菌操作：本产品仅供类器官体外培养，实验室需具备培养条件，并且实验过程涉及的所有试剂和耗材必须保持无菌以防止污染。

(4)   操作环境：组织样本在采集过程中应遵循全程冰上操作；运输应使用组织运输保存液（SA321701）并始终保持 4℃运输环境。样本处 理时应使用预冷的处理试剂以维持细胞活性。

(5)   个小鼠防护：操作时需做好个人防护 ，身着合适的实验服并佩戴一次性口罩和手套。使用过程中产生的废弃物应按照医疗垃圾处理标准妥善处理。

(6)   本产品培养结果会受到组织采集过程、组织样本质量等因素影响；同时也受到技术人员操作习惯、操作环境以及当前细胞生物学技术发展局限性等限制 ，因此可能会存在培养失败的情况。

免责声明：本产品仅用于科学研究用途。用户需自行承担使用产品的全部风险。生产商不对因使用本产品引起的任何间接或附带损害承担责任。建议使用者根据自身实验体系进行条件优化。